作者：郭燕、蔡孟浩 摄影：郭燕
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蔡孟浩课题组在非常规酵母从头生物合成香兰素方面取得重要进展。通过构建从头合成途径、阻断氧化还原转化、代谢途径与辅因子平衡、关键酶改造促进中间体转化等策略，实现迄今报道的香兰素从头生物合成最高产量，相关成果以“Metabolic and enzyme rewiring enables high-production of vanillin in unconventional yeast”为题，在线发表于《代谢工程》期刊 (Metabolic Engineering)。
香兰素（即香草醛）被誉为“香料皇后”，广泛用于食品、医药和日化等领域，全球市场需求巨大。当前，香兰素工业生产主要以化学转化合成为主，高端应用领域的天然香兰素主要依赖于热带香草兰花豆荚中提取，产量不足、成本高昂。合成生物学技术的快速发展，使微生物细胞工厂发酵生产香兰素成为可能，为传统植物提取与化学合成提供了新的可持续替代方案。近年来，香草醛从头生物合成为其生物制造带来新机遇：在模式宿主大肠杆菌与酿酒酵母中，逐步实现基于莽草酸路径或L-酪氨酸—对香豆酸路径的香草醛合成途径构建。然而，胞内关键酶活性不足、香草醛及中间体高毒性、胞内氧化还原反应复杂等问题，严重限制了微生物细胞工厂中香草醛的合成能力。
非常规酵母巴斯德毕赤酵母具备生长密度高、代谢应激耐受能力佳、胞内酶共表达能力强等特点，使其有望成为香草醛生物合成的替代性宿主，但相关研究尚缺乏系统探索。基于此，作者检验了香草醛合成途径多个关键酶的功能并重构从头合成途径，但初始滴度仅0.5 mg/L，氧化还原副反应是限制香草醛有效积累的主要瓶颈。针对该问题，作者基于NCBI数据库比对筛选，在毕赤酵母基因组中锁定了29个潜在的氧化还原酶候选基因，14个内源氧化还原酶叠加组合敲除优化，有效阻断了香草醛降解支路，实现产量提升11.1倍。其中，PAS_chr2-1_0542编码的假定苯偶姻还原酶与PAS_chr4_0754编码的过氧化物酶体2,4-烯酰-CoA还原酶为此前未报道且对香草醛代谢影响显著的关键酶。
图片说明：毕赤酵母代谢及酶工程改造高效合成香兰素
在此基础上，通过系统代谢工程增强前体供给并优化NADPH 与SAM辅因子循环，进一步将香草醛产量提升19.9倍。但代谢通量增加也引发中间体咖啡酸积累，制约了目标产物的转化合成效率。强化咖啡酸-O-甲基转移酶（NtCOMT）无法有效缓解该中间体累积问题，暗示受限于酶本身活性不足。基于此，作者界定了活性中心5-8Å范围内的关键氨基酸残基，通过丙氨酸扫描锁定N312、H315为潜在关键位点，采用饱和突变与迭代饱和突变获得优势突变体NtCOMTN312A/H315N，使其催化活性提升49.7%。分子动力学模拟和通道参数分析表明，突变体活性的提升主要源于底物通道几何优化与催化环境重塑，降低位阻并稳定过渡态，同时提高构象柔性与通道开放度，从而提升催化活性。将酵母基因组中的NtCOMTWT原位替换为NtCOMTN312A/H315N，所得工程菌株未检测到咖啡酸残留，以葡萄糖为碳源进行反应器发酵，实现香草醛产量达731.3 mg/L。采用葡萄糖与咖啡酸偶联补料策略，香草醛产量进一步提升至1055.9 mg/L，暗示进一步强化胞内咖啡酸合成通量有望再次提升香草醛从头合成的潜力。
相关策略及结果证明了代谢工程及酶工程协同改造策略的有效性，也为更高效的目标分子从头合成提供了新思路。相关工作也为毕赤酵母合成芳香醛类及更广泛羰基化合物的绿色制造提供了参考。
该论文第一作者为博士生郭燕，通讯作者为蔡孟浩教授，研究工作得到国家重点研发计划、上海市探索者计划等项目的支持。
原文链接：//doi.org/10.1016/j.ymben.2025.10.002。